Besoin d’aide dans la réalisation de vos ELISA ?

Ces quelques conseils peuvent vous aider !

Mener à bien un test ELISA, c’est faire face à de nombreux problèmes qui doivent être résolus afin d’obtenir des résultats précis et sans artefacts. Vous trouverez dans cet article quelques conseils de dépannage à quatre problèmes les plus rencontrés dans la mise au point de votre ELISA.

 

1. Mauvaise courbe standard

L’obtention d’une bonne courbe standard est peut-être le point la plus important de votre analyse ELISA. À partir de cette courbe, vous êtes en mesure de déterminer la concentration de l’analyte (peptide, protéine, anticorps, metabolite… cible) contenu dans votre échantillon. Vous trouverez ci-dessous quelques causes communes pouvant être à l’origine d’une courbe étalon incorrecte.

Exemple de courbe étalon obtenu avec le kit 8-Isoprostane ELISA Kit de Cayman (Réf. 516351)

Cause n°1 : erreur de pipetage

L’erreur de pipetage est l’une des causes les plus courantes d’une courbe standard mal ajustée. Ce type d’erreur entraîne un volume incorrect des réactifs ajoutés dans les puits, et parfois des points aberrants sur la courbe étalon (ou résultats aberrants pour un échantillon).
Il est d’abord important de s’assurer que vos pipettes sont calibrées avec précision et utilisées conformément aux normes du fabricant, en particulier lorsque vous utilisez des pipettes multicanaux.
La méthode opératoire du pipetage d’abord doit être maitrisée.

Assurez-vous que :

• 1. La pointe est fermement scellée sur la pipette
• 2. Les embouts sont changés entre chaque réactif et chaque échantillon.
• 3. Il n’y a pas de bulles d’air dans le puits ou l’embout de la pipette.
• 4. Le réactif/échantillon est distribué contre le côté du puits pour minimiser le risque d’éclaboussures et de contamination croisée, et la formation de bulles.
• 5. [procédure optimale] Les embouts sont « rincés » au moyen de cycles d’aspiration/dépôt successifs.

Cause n° 2 : dilutions sériées inadéquates

La méthode opératoire du pipetage ne doit pas varier entre chaque dilution ! Il est conseillé de ne pas omettre un pipetage préliminaire pour rincer le cône, ou changer d’un pipetage standard à un pipetage différentiel.
Ensuite le pipetage de la solution mère de standard, de l’échantillon concentré, ou des réactifs peut être critique si la solution est plus ou moins visqueuse, dense, propice à faire des bulles, volatile, Une pipette à déplacement positif, plutôt qu’à déplacement d’air, est alors recommandée.

Cause n° 3 : solution étalon dégradée/incorrecte

Une autre cause fréquente à l’obtention d’une mauvaise courbe standard est la dégradation du standard, ou des réactifs. Cette dégradation peut-être la conséquence d’un mauvais stockage des solutions mères et des réactifs contenus dans le kit ELISA. Assurez-vous que la solution mère soit diluée et stockée conformément au protocole du fabricant, le récipient refermé sans tarder après usage. Un étalon dégradé donne le plus souvent des valeurs de densité optique (DO) plus faibles que prévu, ou parfois aussi plus élevé (avec un Immunoessai en inhibition ou compétition).

Par contre une courbe standard évoluant anormalement fortement ou faiblement que dans les hautes ou moyennes ou basses concentrations, ou avec un seul point aberrant, vous aiguillera vers un problème de pipetage. Pensez enfin à vérifier vos calculs de dilution, et la chronologie des étapes !

 

 

2. Bruit de fond élevé

À l’issue d’un test ELISA, la capacité à obtenir des résultats précis et fiables à partir de vos données dépend fortement du rapport signal/bruit. Un faible rapport signal de détection/bruit de fond réduit la sensibilité de votre analyse. Vous trouverez ci-dessous quelques-unes des causes courantes à un bruit de fond élevé et des solutions afin de le faire diminuer.

Cause n° 1 : étapes de lavage insuffisantes

Les étapes de lavage indiquées dans le protocole sont cruciales pour éliminer tout réactif non lié à la surface active et non active des puits de la plaque : les anticorps, les protéines et le réactif de détection non spécifiquement liés peuvent augmenter considérablement le bruit de fond et générer des faux positifs pour la détection, rendant le signal spécifique indiscernable du bruit de fond.

Assurez-vous que l’échantillon ou réactif, puis le tampon de lavage soit complètement éliminé à chaque étape du lavage de la plaque ELISA : en lavage manuel retournez la plaque sur un papier absorbant, tapotez la plaque 2-3 fois. Avec un laveur automatique de microplaques, vérifiez bien le positionnement des peignes en position basse au ras du fond des puits (sans toucher !), et en position haute (plus haut que le volume distribué par puits !). Le circuit de distribution doit être nettoyé avant l’utilisation (rinçage préliminaire).

Cause n° 2 : tampon de blocage insuffisant

Une autre cause fréquente de bruit de fond élevé dans les ELISA est l’utilisation d’un agent bloquant inadéquate pour l’immunoessai, ou d’une concentration insuffisante ou non optimisée de tampon bloquant. L’étape de blocage est essentielle pour limiter le bruit de fond et parfois critique (avec certains antigènes/analytes, tests très sensibles, en fluorescence et luminescence). Idéalement, le tampon de blocage se liera à tous les sites d’interaction non spécifique sans altérer ou interférer avec l’épitope cible pour la liaison des anticorps et la détection ultérieure. Si vos résultats montrent un bruit de fond élevé, essayez d’augmenter la concentration du bloquant, le volume distribué par puits, ajoutez un peu de Tween20 (0.1%), voire comparez différents agents bloquants.

Cause n° 3 : périodes d’incubation

Il est important de respecter strictement les temps d’incubation indiqués dans les protocoles pour les kits ELISA commerciaux. Les allonger peut nuire au rapport signal / bruit de fond, et surtout pour les tests en inhibition/compétition. Pour un immunoessai ELISA maison avec un protocole de routine, même si vous développez un ELISA utilisant des paires d’anticorps commerciales, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire.

 

 

3. Signal faible ou inexistant

Un signal faible ou absent peut signifier que la concentration de la protéine cible dans votre échantillon est faible ou indétectable. Si vous avez confiance dans vos échantillons et savez qu’ils ne se sont pas dégradés, l’explication la plus probable est qu’il y a un problème avec le test lui-même, ou les réactifs qui le composent.

Cause n°1 : les réactifs ne sont pas à la température recommandée par le fabricant

Il est important de réaliser votre dosage en respectant les températures d’incubation préconnisées par le fabriquant. Il en général recommandé d’amener tous les réactifs à température ambiante (15-20min) avant de mettre en place et de faire fonctionner le test ELISA, pour standardiser les équilibrations thermiques.

Cause n° 2 : Anticorps de capture/détection insuffisant ou incorrect

Lorsque vous développez votre propre ELISA en interne, il vous faut calibrer l’antigène (ou l’anticorps) coaté sur la plaque, l’anticorps primaire et les autres réactifs (anticorps secondaire ; substrat enzymatique coloré). En cas de résultats inadéquates vérifiez les dilutions de chaque réactif et assurez-vous que les volumes sont corrects si vous avez conservé vos tubes de réserve dilués.

Cause n° 3 : puits d’échantillon endommagé

La plupart des kits des fabricants sont livrés avec des plaques pré-revêtues d’un anticorps de capture. Vérifiez après les avoir déballées et avant de les lire au spectromètre, par-dessus et par-dessous (le fond) que les puits sont propres, non rayés ou tachés ou empoussiérés. Les embouts de pipettes et de laveurs automatiques peuvent rayer et endommager les parois des puits d’échantillonnage lors de l’aspiration dans et hors de la plaque. Comme mentionné précédemment, si vous pipettez à la main, placez doucement l’embout contre le côté et au tiers supérieur du puit pour éviter les éclaboussures et d’endommager la surface active des puits. Si vous utilisez un laveur de plaques automatique, assurez-vous que la machine est correctement calibrée et que la plaque est positionnée de manière à ce que les pointes de son peigne répartiteur ne touchent pas le fond ou les côtés du puits d’échantillon.

 

 

4. Coefficient de variation (CV) élevé

Vous souhaitez avoir un coefficient de variation (CV) aussi faible que possible pour vos analyses ELISA, c’est-à dire une faible variabilité de signal mesuré entre puits d’analyses identiques. Les causes suivantes peuvent être à l’origine d’un CV élevé.

Cause n° 1 : Bulles dans les puits

Lorsque vous pipettez des réactifs et des échantillons dans la plaque, vous pouvez voir de petites bulles se former dans les puits. Il est extrêmement important d’éliminer ces bulles à chaque étape du test ELISA, et notamment pour la lecture finale : Leur présence affecte directement la lecture de l’absorbance et entraîne donc des concentrations incorrectes dans chaque échantillon. Lorsque vous pipettez à la main, faites attention : distribuez avec un angle de 45 degrés et aspirez à un angle de 90 degrés. Après avoir complètement distribué le liquide de votre pipette, relâchez le piston lentement et avec précaution pour réduire le risque de formation de bulles, qui perturbera la distribution suivante. Bien que cela puisse prendre du temps, un pipetage soigneux peut s’avérer un facteur majeur pour vous éviter le casse-tête de résultats incohérents.

Cause n° 2 : lavage insuffisant

Une autre cause potentielle d’un CV élevé est que les puits d’échantillonnage n’ont pas été lavés de manière égale. Voir le paragraphe pour la réalisation du lavage quant à son possible impact sur le bruit de fond (mais aussi les bulles et puits endommagés). Avec un laveur de plaques, il arrive que certaines rangées (ou colonnes) soient moins bien lavées. Il faut alors revoir les réglages du laveur, déboucher un tuyau, réaligner un tube du peigne distributeur.

Cause n° 3 : effet de bord

L'”effet de bord” est un problème assez courant qui se manifeste ainsi : les puits situés au bord de la plaque d’échantillon présentent une absorbance différente (soit plus élevée, soit plus faible) que ceux situés à l’intérieur (figure 2) :

Figure 2. Une illustration de l'”effet de bord” sur une plaque ELISA 96 puits. Les puits périphériques surlignés en rouge indiquent une absorbance différente de celle de l’intérieur, indiquée en bleu.

 

Cet effet est généralement causé par une différence de température à travers la plaque, notamment en début des incubations et des distributions de réactifs, ce qui affecte la cinétique des réactifs dans chaque puits, et donc les mesures d’absorbance. Il y a aussi une éventuelle différence d’évaporation. Afin d’éviter ou limiter l’effet de bord, il est recommandé, si tel n’est pas déjà pratiqué, d’utiliser un couvercle de microplaques, et de réaliser les incubations dans un incubateur. Enfin l’effet de bord peut, sur des plaques de qualité médiocre, résulter de leur fabrication et qualité du plastique (PS).

Notre offre riche de plus de plus de 20 000 kits ELISA s’étoffe tous les jours. Retrouvez les dans nos principales gammes de distribution :